微量雜質(zhì)干擾科學(xué)觀測(cè)不僅在偶聯(lián)反應(yīng)催化中存在

今年初《自然催化》雜志發(fā)表一篇中國(guó)科學(xué)家有關(guān)胺催化Suzuki反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)，因?yàn)檫@個(gè)反應(yīng)通常需要過(guò)渡金屬鈀的催化、所以文章發(fā)表后就引起不少專家質(zhì)疑。德國(guó)和匈牙利的科學(xué)家用靈敏的檢測(cè)技術(shù)測(cè)定了胺催化劑中的鈀含量，確實(shí)發(fā)現(xiàn)這些有機(jī)催化劑中有每公斤毫克級(jí)的鈀存在。最近這篇文章正式撤稿，作者做個(gè)更深入的研究發(fā)現(xiàn)卻是是微量鈀絡(luò)合物催化了這個(gè)反應(yīng)?，F(xiàn)代有機(jī)化學(xué)中鈀幾乎無(wú)處不在，所以很難找到完全沒(méi)有鈀的反應(yīng)環(huán)境、造成多個(gè)小組先后發(fā)現(xiàn)所謂無(wú)鈀催化偶聯(lián)反應(yīng)的烏龍。

藥源解析

微量雜質(zhì)干擾科學(xué)觀測(cè)不僅在偶聯(lián)反應(yīng)催化中存在，藥物化學(xué)中同樣存在大量類似干擾因素，所以初篩得到的苗頭化合物通常要經(jīng)歷一系列的反向篩選(counter screen)去把在你篩選化合物所用測(cè)試中有一定表觀活性、但無(wú)法繼續(xù)優(yōu)化濫竽充數(shù)、狐假虎威的不靠譜分子從革命隊(duì)伍了清理出去。隨著中國(guó)制藥企業(yè)進(jìn)入更早期新藥研發(fā)的競(jìng)爭(zhēng)，這個(gè)工作會(huì)逐漸提到議事議程。大小分子藥物先導(dǎo)物產(chǎn)生有很大區(qū)別，今天主要談?wù)勑》肿铀幬锵葘?dǎo)物發(fā)現(xiàn)的反向篩選。

與跟蹤策略如me-too、me-better一開(kāi)始就有優(yōu)質(zhì)先導(dǎo)物不同，全新靶點(diǎn)藥物開(kāi)發(fā)你是從零開(kāi)始的。立項(xiàng)不在是根據(jù)別人靶向這個(gè)靶點(diǎn)的藥物在二期臨床已經(jīng)有了陽(yáng)性數(shù)據(jù)，而是要根據(jù)細(xì)胞、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(多數(shù)是基因敲除實(shí)驗(yàn))、人體基因變異等間接數(shù)據(jù)去判斷，這本身是一個(gè)高度復(fù)雜的工作、但不在今天的討論范圍內(nèi)。你看好一個(gè)靶點(diǎn)后首先要表達(dá)這個(gè)蛋白，這雖然不是個(gè)閑庭信步的事、但不是主要障礙。下一步就是要有一個(gè)足夠大、足夠多樣化的化合物庫(kù)，這個(gè)就需要長(zhǎng)期積累才能做到。DEL雖然可以快速產(chǎn)生數(shù)億級(jí)別的庫(kù)但多樣性非常有限，高質(zhì)量小分子庫(kù)需要數(shù)十年的積累。

有了靶點(diǎn)蛋白和供篩選的化合物庫(kù)，下一個(gè)任務(wù)是設(shè)計(jì)篩選標(biāo)準(zhǔn)(assay)。因?yàn)槟銓?duì)未來(lái)先導(dǎo)物一無(wú)所知所以通常要篩選大量化合物，這要求你的篩選通量要達(dá)到一定水平、也不能消耗太多化合物。直接看動(dòng)物模型療效一般是不行的，一是一年也篩不了幾個(gè)化合物、二是這么篩的話兩個(gè)項(xiàng)目就把你化合物庫(kù)掏空了?，F(xiàn)在常用的高通量測(cè)試方法主要是根據(jù)配體與靶標(biāo)蛋白結(jié)合力和對(duì)蛋白功能(如催化、受體信號(hào)傳遞對(duì)等)的調(diào)控，不需要多少化合物、測(cè)試速度和通量也高。但是這類所謂高通量篩選也比較糙，經(jīng)常會(huì)發(fā)生類似無(wú)鈀催化偶聯(lián)反應(yīng)這種烏龍、需要反向篩選剔除假陽(yáng)性苗頭化合物。

第一件事就是看看你化合物的純度，有些化合物不穩(wěn)定、長(zhǎng)時(shí)間放置會(huì)降解，有些合成時(shí)就沒(méi)純化好，有些可能結(jié)構(gòu)就定錯(cuò)了。這些明顯的錯(cuò)誤糾正后就要考慮隱藏比較深的雜質(zhì)了，類似微量鈀對(duì)偶聯(lián)反應(yīng)的影響。很多靠Cys催化的酶因?yàn)閹€基可與過(guò)渡金屬絡(luò)合所以對(duì)微量金屬非常敏感，nM水平的金屬就可以抑制這些酶的活性、導(dǎo)致大量含有過(guò)渡金屬的化合物樣品給出假陽(yáng)性數(shù)據(jù)。加入EDTA清除游離過(guò)渡金屬通?？梢韵@類干擾。

即使活性真正來(lái)自結(jié)構(gòu)式所指向的化合物，有些化合物也是無(wú)法優(yōu)化的。比如有些化合物在uM濃度容易形成聚合物(aggregation)令蛋白，所以給出uM活性、但無(wú)論你怎么改造結(jié)構(gòu)也不會(huì)提高活性。把這類妖怪打回原形的辦法是稀釋測(cè)試系統(tǒng)，因?yàn)闊o(wú)法形成聚合物所以活性消失。還有一些化合物含有一些可以與蛋白表面親核氨基酸反應(yīng)的基團(tuán)，除非是你準(zhǔn)備設(shè)計(jì)共價(jià)化合物并有優(yōu)化路徑否則這類化合物也很難繼續(xù)優(yōu)化。剔除這些干擾可以通過(guò)用靶點(diǎn)蛋白與化合物長(zhǎng)時(shí)間共處，然后用質(zhì)譜、核磁等技術(shù)看看蛋白是否被化學(xué)修飾。

有些蛋白-配體的結(jié)合方式也很難優(yōu)化，如別構(gòu)抑制劑。當(dāng)然現(xiàn)在有人專門挑戰(zhàn)這個(gè)難題，但如果你不想淌這趟渾水你可以把這些優(yōu)化難度高的苗頭化合物除去。如果能拿到配體-蛋白復(fù)合物共晶結(jié)構(gòu)當(dāng)然一目了然，如果沒(méi)有也可以用核磁共振、與已知結(jié)合模式配體競(jìng)爭(zhēng)等技術(shù)定義結(jié)合方式。找到了特異性、非共價(jià)、理想結(jié)合方式的配體后，假如生物學(xué)家也沒(méi)閑著設(shè)計(jì)、驗(yàn)證了評(píng)價(jià)方法，你就可以開(kāi)始艱難的先導(dǎo)物優(yōu)化工作了。除了活性這個(gè)核心外，選擇性、PK、溶解性、過(guò)膜性、常見(jiàn)脫靶活性(cyp、hERG)、基因毒性、安全性、急毒長(zhǎng)毒、甚至CMC生產(chǎn)的任何一個(gè)妖怪都可能讓你前功盡棄。

即使你經(jīng)歷了九九八十一難進(jìn)入臨床，佛祖讓你上市的機(jī)會(huì)也只有不到10%、但這是一個(gè)good problem to have。徹底調(diào)查先導(dǎo)物身份是基礎(chǔ)、識(shí)別烏龍的火眼金睛非常關(guān)鍵，當(dāng)年賽諾菲曾經(jīng)是PARP抑制劑的領(lǐng)頭羊，遺憾的是他們用的化合物卻不是一個(gè)真正的PARP抑制劑。不僅自己失敗兩個(gè)三期臨床損失巨大，還差點(diǎn)把整個(gè)領(lǐng)域帶到溝里。不僅小分子，Medivation還曾經(jīng)收購(gòu)一個(gè)偽PD-1抗體。新藥是極其罕見(jiàn)的物種、哪能輕易遇到?無(wú)論一個(gè)化合物如何溫文爾雅都要進(jìn)行徹底的排查。Trust but verify。

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