2022年1月14日整理發(fā)布：ctDNA的水平與病變所處時期呈正相關

2022年1月14日整理發(fā)布：口腔癌是最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其中鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)約占90%。盡管外科手術、放化療等治療方式不斷進步，OSCC的5年生存率徘徊在60%左右，未見顯著提高，重要原因是2/3以上的患者在初診時已屆腫瘤晚期。

唾液中含有多種與OSCC相關的生物標志物，與血漿的成分常具有平行性。高通量和高靈敏度檢測方法的出現(xiàn)解決了唾液中生物標志物濃度較低的問題。唾液與口腔癌病變部位直接接觸，癌瘤表面壞死的細胞可直接脫落進入口腔，腫瘤細胞分泌的外泌體或其他分子也可以通過主動、被動運輸?shù)韧緩綕B入唾液，且唾液易于收集、無侵入性，可以實時動態(tài)監(jiān)測疾病變化，從而使唾液檢測成為高效的OSCC早期診斷的篩選工具。本文通過對PubMed、中國知網、萬方數(shù)據庫進行檢索，收集近五年的研究性文獻，聚焦循環(huán)腫瘤DNA、細胞外囊泡和循環(huán)腫瘤細胞，綜述相關研究的最新進展。

1.循環(huán)腫瘤DNA(circulating cell-free tumor DNA，ctDNA)

游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)是指在生理細胞更新或特定病理狀態(tài)下，凋亡、焦亡、壞死細胞或活細胞釋放入循環(huán)中的DNA。正常狀態(tài)下，cfDNA會被吞噬細胞降解。但在癌癥患者中，此機制受損，導致cfDNA在體液中累積。由腫瘤細胞釋放的DNA稱ctDNA，可反映腫瘤DNA甲基化、點突變和微衛(wèi)星改變等變化，與病變組織的遺傳學改變相關。

ctDNA在腫瘤轉移中的作用還不明確。癌細胞的轉化可能是正常細胞內化包含ctDNA的囊泡，或直接接受循環(huán)中由原發(fā)灶腫瘤細胞主動釋放的ctDNA后形成的。因此，ctDNA很可能是腫瘤轉移的媒介。ctDNA的水平可以反映腫瘤負荷、進行預后判斷及監(jiān)測腫瘤切除術后腫瘤是否有殘留和復發(fā)。

一般來說，ctDNA的水平與病變所處時期呈正相關，且隨疾病進展而迅速增加，并在成功的治療干預后降低。Desai等對比44例口腔癌、40例口腔癌前病變患者、40例無口腔病變吸煙者和40例不吸煙的健康對照者血漿的cfDNA水平，發(fā)現(xiàn)口腔癌組的總cfDNA水平更高，且總cfDNA水平與淋巴結轉移(P=0.001)和臨床分期(P=0.006)呈正相關。Mazurek等對200例頭頸鱗癌患者血漿的總cfDNA水平進行測定，結果顯示，與正常對照相比，腫瘤患者的cfDNA水平增加，口咽癌患者增加更為顯著。

Lin等的結果也支持了血清cfDNA水平越高，OSCC患者的預后越差這一觀點。cfDNA的水平會受炎癥、吸煙、免疫等多種因素影響，而ctDNA更具特異性。雖然ctDNA主要釋放入血液，但可以通過唾液腺的超濾作用、局部病灶主動或被動運輸?shù)榷喾N途徑在唾液中富集。唾液中富含來自口腔腫瘤的DNA，而血清則富含來自其他部位腫瘤的DNA。因此，在口腔癌中，唾液ctDNA檢測的敏感性高于血清。

Wang等報告，口腔癌患者唾液中ctDNA的檢出率為100%，高于其他部位的頭頸鱗癌患者，且腫瘤復發(fā)患者的ctDNA改變先于影像學改變，這提示唾液ctDNA檢測可用于口腔癌的早期診斷和腫瘤復發(fā)的監(jiān)測。ctDNA不僅可作為腫瘤的生物標志物，也可以用于腫瘤異質性的鑒別。ctDNA攜帶的遺傳學改變信息對口腔癌發(fā)生的分子機制的研究有重要意義。

Schrock等[的研究結果顯示，血清中ctDNA甲基化的檢測可有效應用于頭頸鱗癌的診斷和患者預后的評估。SHOX2和SPEPT9兩個基因甲基化作為腫瘤的生物標志物已在649例頭頸癌患者的前瞻性隊列研究中得到驗證，ctDNA的甲基化水平與淋巴結轉移和死亡率有關，且在臨床出現(xiàn)復發(fā)和轉移前即可檢測到ctDNA甲基化水平的升高。

有學者報告，OSCC患者的腫瘤組織及血清中的ctDNA都存在著微衛(wèi)星不穩(wěn)定，且與腫瘤分期相關。ctDNA也被用于腫瘤的耐藥性監(jiān)測及腫瘤患者對治療反應的連續(xù)監(jiān)測。但ctDNA在癌前病變患者中的應用價值有待進一步研究。

2.細胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)

EVs可以分為兩類：一類是通過出芽直接從細胞膜脫落的微泡，包括直徑約50nm至1μm的微囊泡、微粒和大囊泡;另一類是外泌體，大小約30~150nm，由多囊泡體與質膜融合時通過胞吐作用釋放。在不少研究中，存在著外泌體和EVs名稱混用的現(xiàn)象，而目前的分離純化技術可以鑒定不同類型的囊泡，因此有學者建議使用囊泡亞型名稱以示區(qū)分。

研究表明，EVs通過表面配體與靶細胞受體的識別結合、內吞作用或與質膜融合釋放內含物等方式，參與細胞間的信息交流，調節(jié)細胞生命活動，介導腫瘤微環(huán)境形成和上皮間質轉化等過程，進而調控腫瘤發(fā)生、侵襲和轉移。腫瘤來源的EVs還可以通過免疫抑制和免疫刺激信號與免疫細胞交流從而調控腫瘤的發(fā)展。

有學者致力于研究EVs對腫瘤早期診斷的作用。EVs富含多種miRNA，通過直接與鄰近細胞或經血液循環(huán)與遠處細胞信息交流調節(jié)腫瘤生長及侵襲。miRNA具有組織特異性，在不同腫瘤中表達不同，在不同來源的外泌體中表達也有差異。與口腔癌相關、表達上調的miRNA有miR-21，miR-455-5p，miR-155-5p，miR-372，miR-373，miR-29b，miR-1246，miR-196a和miR-181，而表達下調的miRNA有miR-204，miR-101，miR-32，miR-20a，miR-16，miR-17和miR-125b。

Rabinowits等報告，外泌體中miRNA的表達模式比循環(huán)游離miRNA更貼近腫瘤組織中miRNA的表達，因此認為將外泌體中的miRNA作為生物標志物信度更高。通過檢測唾液外泌體中差異表達的miRNA，可以實現(xiàn)對口腔癌的早期診斷。但是目前沒有明確的、可用于臨床檢測的miRNA分子，對唾液來源的腫瘤外泌體的內含物的研究報道也較少。miR-21是研究較多的生物標志物，在OSCC患者的外泌體中表達增高。

Li等的研究結果顯示，低氧微環(huán)境可以刺激腫瘤細胞產生富含miR-21的外泌體，促進腫瘤細胞遷移。Liu和Chen等的研究均顯示EVs介導的順鉑耐藥性與miR-21有關。miR-21與促炎促腫瘤微環(huán)境的建立密不可分。Momen-Heravi等報告，單核細胞攝取富含miR-21的EVs后，激活NF-κB途徑，增加白細胞介素-6、趨化因子CCL-2、基質金屬蛋白酶-9等促炎因子的表達，從而促進炎癥過程和腫瘤發(fā)展。

陳瑩的研究結果顯示，OSCC患者血液和唾液來源的EVs中，miR-21-5p的表達趨勢基本一致，呈正相關(R2=0.6951)，Pearson相關性為0.834(P<0.05)，且OSCC患者唾液EVs中miR-21-5p的表達水平在術后顯著降低，可以用于預后判斷。Dioguardi等對miR-21用于口腔癌的早期診斷進行了系統(tǒng)評價和薈萃分析，其靈敏度為0.771(95%CI0.680～0.842)(P<0.001)，而特異性為0.663(95%CI0.538～0.770)(P<0.001)，均顯示了miR-21作為口腔癌診斷標志物和治療靶點的可能性。

Langevin等對體外培養(yǎng)的頭頸鱗癌4種細胞系中分離出的外泌體進行了miRNA測序，篩選其中最廣泛表達的miRNA并在患者唾液中進行驗證。結果顯示，miR-486-5p與miR-10b-5p在患者和健康對照組唾液的外泌體中存在差異表達，但敏感度較低。Gai等分析5例OSCC患者和5例健康對照者唾液外泌體的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-302b-3p和miR-517b-3p僅在OSCC患者中表達，而miR-512-3p和miR-412-3p在OSCC患者中呈現(xiàn)高表達。

He等提出，唾液外泌體中miR-24-3p是OSCC潛在的新型腫瘤診斷生物標志物。此外，長非編碼RNA在OSCC早期診斷中也有重要意義，但尚未見EVs中長非編碼RNA與OSCC關系的報道。唾液中的微囊泡也可用于OSCC的早期診斷。Zhong等純化并定量分析了65例OSCC患者唾液中的微囊泡，并以21例口腔潰瘍患者和42例健康志愿者做對照。結果顯示，OSCC患者唾液中的微囊泡水平顯著升高，唾液微囊泡水平與OSCC患者的存活率呈負相關，提示其可能是OSCC惡性進展的標志物。

3.循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)

CTCs是由腫瘤原發(fā)灶或轉移灶釋放入血液循環(huán)中的細胞，攜帶多數(shù)與原發(fā)灶相同的突變譜，參與腫瘤自種植，極有可能是癌癥轉移的“先鋒”。在癌癥患者的血液中，CTCs可以有單細胞或細胞簇兩種形式。CTCs細胞簇具有免疫逃逸的能力，可以更快地形成種植性腫瘤，在血液中存在的時間短而不易被檢測到。

Oliveira-Costa等研究OSCC患者的基因表達譜，在對CTCs的分析中觀察到，PD-L1，HOXB9和ZNF813表達增高，BLNK的表達降低，這一結果與原發(fā)腫瘤的基因表達譜相符。多項研究結果表明，CTCs的水平與口腔癌患者生存率和治療效果相關。對CTCs表面藥物分子靶點的研究可能有助于精準免疫治療藥物的研發(fā)。

CTCs主要根據其分子大小和生物學特性(表面的蛋白質標志物)而被分離出來，但與良性上皮細胞不易區(qū)分。在CTCs檢測技術中，F(xiàn)DA批準在臨床使用的是CellSearch系統(tǒng)，CTCs對上皮細胞黏附分子抗體及細胞角蛋白8，18和19呈陽性表達，CD45呈陰性表達，但此法可能會丟失CTCs細胞簇，導致血液中實際CTCs的總數(shù)偏低。

無標記慣性微流體途徑(label-free inertial microfluidics approach，LFIMA)克服了這一缺點。Kaoro等提出采用新一代測序技術結合LFTMA檢測CTCs和ctDNA，結果顯示，組合分析CTCs和ctDNA可以擴展液體活檢所揭示的基因組譜變化的范圍。Morgan等報告了一種新的方法，即表面增強拉曼光譜散射納米技術，實現(xiàn)了CTCs的精準檢測。CTCs檢測雖然在腫瘤監(jiān)測、分子靶向治療、藥敏實驗等方面展現(xiàn)出良好的應用前景，但其精確性和對臨床的指導作用有待提高。這依賴于精確的分析技術和生物信息學工具的利用。目前的研究多限于血樣分析，唾液中是否存在主動釋放的腫瘤細胞尚未可知。

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