新型可逆CRISPR方法可控制基因表達(dá)且保持基礎(chǔ)DNA序列不變

在過去的十年中，CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)徹底改變了基因工程，使科學(xué)家能夠?qū)ι矬w的DNA進(jìn)行有針對(duì)性的改變。盡管該系統(tǒng)可能潛在地用于治療多種疾病，但CRISPR-Cas9編輯涉及切割DNA鏈，從而導(dǎo)致細(xì)胞遺傳物質(zhì)的永久改變。

現(xiàn)在，在4月9日在線發(fā)表在Cell上的一篇論文中，研究人員描述了一種稱為CRISPRoff的新基因編輯技術(shù)，該技術(shù)使研究人員可以在不改變DNA序列的情況下，以高特異性控制基因表達(dá)。該方法由懷特海德研究所成員喬納森·韋斯曼，加利福尼亞大學(xué)舊金山分校助理教授盧克·吉爾伯特，韋斯曼實(shí)驗(yàn)室的博士后詹姆斯·努涅茲和合作者設(shè)計(jì)，該方法足夠穩(wěn)定，可以通過數(shù)百個(gè)細(xì)胞分裂進(jìn)行繼承，并且是完全可逆的。

韋斯曼說：“這里最重要的是，我們現(xiàn)在有了一個(gè)可以沉默絕大多數(shù)基因的簡(jiǎn)單工具，”韋斯曼說，他也是麻省理工學(xué)院的生物學(xué)教授，也是霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所的研究員。“我們可以同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行此操作，而不會(huì)造成任何DNA損傷，而且具有很高的同質(zhì)性，并且可以逆轉(zhuǎn)。這是控制基因表達(dá)的絕佳工具。”

該項(xiàng)目部分由國(guó)防高級(jí)研究計(jì)劃局(Defense Advanced Research Projects Agency)于2017年提供的資金，用于創(chuàng)建可逆基因編輯器。共同資深作家吉爾伯特(Gilbert)說：“從最初的撥款開始，已經(jīng)快了四年，而CRISPRoff終于按照科幻小說的方式工作了。” “看到它在實(shí)踐中如此出色，真是令人興奮。”

基因工程2.0

經(jīng)典的CRISPR-Cas9系統(tǒng)使用一種在細(xì)菌免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的稱為Cas9的DNA切割蛋白。該系統(tǒng)可以針對(duì)特定基因在人細(xì)胞中使用單個(gè)導(dǎo)RNA，其中所述的蛋白質(zhì)Cas9創(chuàng)建在DNA鏈微小斷裂。然后，該單元的現(xiàn)有維修工具修補(bǔ)了孔。

由于這些方法會(huì)改變基本的DNA序列，因此它們是永久性的。另外，它們依賴于“內(nèi)部”細(xì)胞修復(fù)機(jī)制，這意味著很難將結(jié)果限制為單個(gè)所需的改變。Weissman說：“與CRISPR-Cas9一樣美麗，它可以修復(fù)復(fù)雜且多方面的自然細(xì)胞過程。” “很難控制結(jié)果。”

研究人員在那里找到了另一種基因編輯器的機(jī)會(huì)，它不會(huì)改變DNA序列本身，而是改變了它們?cè)诩?xì)胞中讀取的方式。

這種修飾就是科學(xué)家所說的“表觀遺傳學(xué)”-基因可能會(huì)基于DNA鏈的化學(xué)變化而沉默或激活。細(xì)胞表觀遺傳學(xué)的問題是造成許多人類疾病(例如脆弱X綜合征和各種癌癥)的原因，并且可以世代相傳。

表觀遺傳基因沉默通常通過甲基化起作用-將化學(xué)標(biāo)簽添加到DNA鏈的某些位置-導(dǎo)致DNA變得無法進(jìn)入RNA聚合酶，該酶將DNA序列中的遺傳信息讀入信使RNA轉(zhuǎn)錄本，最終可以成為蛋白質(zhì)的藍(lán)圖。

Weissman和合作者以前曾創(chuàng)建過另外兩個(gè)表觀遺傳編輯器，稱為CRISPRi和CRISPRa，但兩者都帶有警告。為了使它們?cè)诩?xì)胞中發(fā)揮作用，細(xì)胞必須不斷表達(dá)人造蛋白質(zhì)以維持變化。

吉爾伯特說：“借助這項(xiàng)新的CRISPRoff技術(shù)，您可以[簡(jiǎn)短地表達(dá)一種蛋白質(zhì)]編寫一個(gè)程序，該程序可以被細(xì)胞無限地記住并執(zhí)行。” “它改變了游戲規(guī)則，所以現(xiàn)在您基本上是在寫一個(gè)通過細(xì)胞分裂傳遞下來的改變—在某些方面，我們可以學(xué)習(xí)創(chuàng)建更安全，同樣有效的CRISPR-Cas9 2.0版，并且可以完成所有這些工作還有其他事情。”

構(gòu)建交換機(jī)

為了構(gòu)建可以模仿天然DNA甲基化的表觀遺傳編輯器，研究人員創(chuàng)建了一個(gè)微型蛋白質(zhì)機(jī)器，該機(jī)器在小RNA的引導(dǎo)下可以將甲基粘在鏈的特定斑點(diǎn)上。然后將這些甲基化的基因“沉默”或關(guān)閉，因此命名為CRISPRoff。

因?yàn)樵摲椒ú粫?huì)改變DNA鏈的序列，所以研究人員可以使用去除甲基的酶來逆轉(zhuǎn)沉默效果，他們將這種方法稱為CRISPRon。

當(dāng)他們?cè)诓煌瑮l件下測(cè)試CRISPRoff時(shí)，研究人員發(fā)現(xiàn)了新系統(tǒng)的一些有趣功能。一方面，他們可以將這種方法針對(duì)人類基因組中的絕大多數(shù)基因—它不僅對(duì)基因本身有效，而且對(duì)控制基因表達(dá)但不編碼蛋白質(zhì)的DNA其他區(qū)域也有效。第一作者努涅斯說：“即使是對(duì)我們來說，這也是巨大的震驚，因?yàn)槲覀冋J(rèn)為這僅適用于基因的一個(gè)子集。”

此外，令研究人員驚訝的是，CRISPRoff甚至能夠沉默沒有被稱為CpG島的大甲基化區(qū)域的基因，該基因以前被認(rèn)為是任何DNA甲基化機(jī)制所必需的。

吉爾伯特說：“在這項(xiàng)工作之前，人們?cè)J(rèn)為30%沒有CpG島的基因不受DNA甲基化的控制。” “但是我們的工作清楚地表明，您不需要CpG島就可以通過甲基化來關(guān)閉基因。對(duì)我來說，這是一個(gè)很大的驚喜。”

CRISPRoff在研究和治療中

為了研究CRISPRoff在實(shí)際應(yīng)用中的潛力，科學(xué)家在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中測(cè)試了該方法。這些細(xì)胞可以根據(jù)其所接觸的分子的混合物在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為無數(shù)種細(xì)胞，因此是研究特定細(xì)胞類型的發(fā)育和功能的強(qiáng)大模型。

研究人員選擇了一種在干細(xì)胞中沉默的基因，然后誘導(dǎo)它們轉(zhuǎn)變?yōu)榉Q為神經(jīng)元的神經(jīng)細(xì)胞。當(dāng)他們?cè)谏窠?jīng)元中尋找相同的基因時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)該基因在90%的細(xì)胞中都保持沉默，這表明即使改變細(xì)胞類型，細(xì)胞也保留了CRISPRoff系統(tǒng)進(jìn)行的表觀遺傳修飾的記憶。

他們還選擇了一個(gè)基因作為CRISPRoff如何應(yīng)用于治療的一個(gè)例子：編碼Tau蛋白的基因，該基因與阿爾茨海默氏病有關(guān)。在神經(jīng)元中測(cè)試了該方法之后，他們能夠證明使用CRISPR-off可以降低Tau的表達(dá)，盡管不是完全關(guān)閉。魏斯曼說：“我們證明這是沉默Tau并阻止該蛋白表達(dá)的可行策略。” “問題是，那么，你如何將其交付給成年人?這真的足以影響阿爾茨海默氏癥嗎?這些問題懸而未決，尤其是后者。”

即使CRISPR-off沒有導(dǎo)致阿爾茨海默氏癥的治療，它也可能有許多其他條件。盡管向特定組織的遞送仍然是諸如CRISPRoff之類的基因編輯技術(shù)所面臨的挑戰(zhàn)，但“我們證明您可以以DNA或RNA的形式瞬時(shí)遞送，這與Moderna和BioNTech疫苗所基于的技術(shù)相同，” Weissman說。

Weissman，Gilbert和合作者也對(duì)CRISPRoff的研究潛力充滿熱情。魏斯曼說：“由于我們現(xiàn)在可以使我們想要的基因組的任何部分保持沉默，所以它是探索基因組功能的好工具。”

另外，擁有一個(gè)可靠的系統(tǒng)來改變細(xì)胞的表觀遺傳學(xué)可以幫助研究人員了解表觀遺傳學(xué)修飾通過細(xì)胞分裂傳遞的機(jī)制。努涅斯說：“我認(rèn)為我們的工具確實(shí)使我們能夠開始研究遺傳力的機(jī)制，特別是表觀遺傳力，這在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)中是一個(gè)巨大的問題。”

標(biāo)簽： CRISPR方法 基因