研究人員報告說新方法使干細胞編輯效率提高了一倍以上

賓夕法尼亞州立大學領導的跨學科研究人員團隊已經(jīng)開發(fā)出提高CRISPR-Cas9效率的技術，CRISPR-Cas9是一種基因組編輯技術，在2020年獲得了諾貝爾獎。雖然CRISPR-Cas9比其他基因編輯方法更快，更便宜，更準確，但根據(jù)賓夕法尼亞州立大學生物醫(yī)學工程和生物學副教授小軍“Lance”Lian的說法，該技術存在局限性 - 特別是在改善人類健康的應用中。

研究人員開發(fā)了一種更有效和更容易獲得的過程，將CRISPR-Cas9系統(tǒng)應用于人類多能干細胞(hPSCs)，來自聯(lián)邦批準的干細胞系，Lian說這可以大大推進遺傳疾病的診斷和治療。該方法于9月7日發(fā)表在《細胞報告方法》上。

CRISPR-Cas9代表簇狀規(guī)則間隔的短回文重復序列和CRISPR相關蛋白9，使科學家能夠靶向遺傳密碼的精確位置以改變DNA，從而提供了創(chuàng)建新的診斷工具和潛在糾正突變的機會，以治療疾病的遺傳原因。

“人類基因組是巨大的，CRISPR-Cas9使科學家有可能發(fā)現(xiàn)并靶向突變基因以進行研究，”Lian說。

CRISPR使用稱為質(zhì)粒DNA的遺傳物質(zhì)盤來遞送引導的核糖核酸(RNA)，該核糖核酸(RNA)將Cas9酶定位在靶基因的精確位置。當DNA被定位時，Cas9與它結(jié)合并切割出來，允許其他DNA修復切割。然后，研究人員可以看到去除如何改變基因的表達。但根據(jù)Lian的說法，目前基于DNA的CRISPR方法存在遞送和編輯效率問題。

“DNA CRISPR效應子的遞送很低，”他說。“使用CRISPR時，只有20%到30%的靶細胞會接受基因編輯DNA。將RNA遞送到細胞中可以更有效;然而，當引入常規(guī)RNA時，細胞可以將其視為病毒。他們在RNA制造蛋白質(zhì)之前破壞RNA- 比如說，在幾個小時內(nèi) - 并且這樣做會破壞基因編輯的嘗試。

為了改善結(jié)果，研究人員改變了基因組編輯工具被遞送到干細胞的方式，使用修飾的RNA(modRNA)。modRNA與質(zhì)粒DNA的不同之處在于，它用化學修飾的版本替換了RNA中發(fā)現(xiàn)的一種堿基底物，并且通過更強的結(jié)構支持來穩(wěn)定它。

“發(fā)現(xiàn)modRNA明顯比質(zhì)粒DNA更有效，”Lian說。“大約90%的細胞從簡單的轉(zhuǎn)染中接收modRNA，因此它能夠保持在原位并完成其工作。

研究人員還發(fā)現(xiàn)，modRNA存在的時間是理想的：足夠長的時間來修飾細胞，但不會太長以至于它會導致脫靶活性。但ModRNA引入了另一個問題，據(jù)Lian說。

當modRNA Cas9成功遞送到靶基因時，它會在基因組中產(chǎn)生雙鏈斷裂，一些細胞會試圖修復。那些修復自己的人可以將修復或“突變”傳遞給他們的后代。這是研究人員想要更好地了解的過程，所以這些是他們想要收獲和研究的細胞。Lian說，問題在于，大多數(shù)有這種斷裂的細胞都將其視為基因組的主要問題，并且會自毀而不是試圖修復自己。

為了減少Cas9的毒副作用并幫助編輯的細胞存活，Lian的團隊引入了一種已知可以幫助細胞生長的小蛋白質(zhì)。根據(jù)Lian的說法，這種添加的蛋白質(zhì)抑制了細胞死亡，并將Cas9編輯效率提高了84%。

研究人員還發(fā)現(xiàn)，modRNA可以改善其他基因編輯技術，如堿基編輯。堿基編輯可以通過使用蛋白質(zhì)來改變單個核苷酸來敲除基因或糾正基因組中的突變，而不是像CRISPR那樣切割兩條鏈。

“我們用基于質(zhì)粒或基于modRNA的堿基編輯蛋白轉(zhuǎn)染干細胞，”Lian說。“我們基于modRNA的方法在成功編輯基因組方面的效率是基于質(zhì)粒的技術的四倍多，為68%，約為16%。

Lian認為，隨著更多的基因編輯實驗室提高基因編輯效率和有效性，研究人員將能夠更快地更好地了解基因及其功能。

“人體有超過20，000個基因，但我們只研究了其中約10%的功能，”Lian說。“檢查每個剩余基因的目的，一次一個，可能需要一生的時間。使用來自我們高效基因編輯技術的工程干細胞可以大大加快這一過程。

標簽：